IDENTIFICACIÓN DE VARIEDADES DE OLIVO MEDIANTE RAPDs

Botánica

Prácticas de Laboratorio

Ecología
Fisiología Vegetal

 

 

 

 

Descripción de la técnica
La técnica RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNA) se basa en la amplificación al azar de fragmentos de PCR mediante la utilización de oligos de secuencias determinadas pero arbitrarias, con lo que se obtiene un patrón de fragmentos que pueden utilizarse como huella del ADN de una determinada especie, variedad o individuo. Esta técnica se diferencia de la PCR en el uso del cebador diseñado al azar.

En un principio, utilizando un oligonucleótido determinado podría obtenerse un patrón de bandas específico para ese individuo. Dependerá de la secuencia que se haya tomada al azar ya que podría ser que una secuencia no nos distinga entre dos individuos distintos. Habría, por tanto, que probar muchos oligonucleótidos hasta encontrar alguno que nos sirva, lo que fuerza a hacer pruebas experimentales.

Necesitamos una muestra de ADN parcialmente purificada, hacer una estimación aproximada de la cantidad de ADN que posee y llevar a cabo una reacción de PCR cuyas características es necesario definir:
- Oligonucleótido usado
- Muestra de ADN
- Número de ciclos de PCR
- Temperatura de apareamiento del cebador al ADN molde

La dificultad que supone la técnica es la puesta a punto.

1. Purificación de ADN genómico a partir de tejido vegetal
No existe un método universal para llevar a cabo la purificación. El objetivo es obtener un ADN de calidad, que no se encuentre demasiado degradado. Sería, por tanto, obtener fragmentos de ADN por rotura mecánica y con ADNasa lo más enteros posibles. Así, no sería aconsejable usar un procedimiento que diese fragmentos de decenas de Kb. Además debe ser un proceso rápido, que pueda ser aplicado simultáneamente y que no sea demasiado costoso.

Por el contrario hay que indicar que no necesitamos que el procedimiento sea de alto rendimiento ya que la cantidad de ADN necesaria para proceder a realizar la PCR es muy pequeña.
Vamos a utilizar una técnica comercial con la que obtendremos entre 1 y 20 ?g de ADN por 100 mg de tejido vegetal, que en nuestro caso serán hojas de olivo. Si quisiéramos obtener un rendimiento máximo habría que elegir unas células con el menor tamaño posible, ya que una célula en crecimiento es más fácil de romper teniendo la misma cantidad de ADN que una que ha completado el crecimiento. Se tomarían, por tanto las hojas más pequeñitas. Asimismo, deberíamos elegir el tejido que presenta una mejor rotura pues evitamos el uso de mecanismos de rotura fuertes que podrían degradar el ADN en exceso. El tejido idóneo para ello sería el tejido mesenquimático.

Dichas estas recomendaciones pasamos a la rotura del tejido. Es necesario evitar en cualquier momento la acción de las ADNasas, pues una vez más, lo que queremos es obtener el ADN lo más entero posible. Para ello hay que estabilizar el extracto tan rápido como podamos. Nosotros vamos a triturar el tejido en nitrógeno líquido y luego suspendemos el tejido pulverizado rápidamente en un tampón que proteja al ADN de las ADNasas. Igualmente, como tenemos ADNasas en la piel hay que usar guantes y evitar tocar las pipetas con las manos o rozar con ellas las superficies.

Se tritura el tejido en un mortero con nitrógeno líquido, hasta que queda una masa más o menos compacta. A continuación se lisa este tejido triturado con dos soluciones de lisis, se agita y voltea con cuidado. Tras se esto se incubará a 65 º C. Pasado un tiempo de incubación hay que añadir solución de precipitación, mezclar y nuevamente incubar, en este caso en hielo. Se somete a centrifugación, ya que lo que nos interesa es separar las dos fases. El sobrenadante se filtra y se guarda.

El siguiente paso es la unión del ADN a una columna de purificación. Antes de realizar este paso se ha debido de preparar dicha columna, equilibrándola con una solución de preparación de la columna. Mientras se centrifuga nuestra muestra y nos quedamos con la membrana del filtro. Al filtrado obtenido anteriormente hay que añadirle una solución de unión y transferimos parte de esta mezcla a la columna ya preparada. Se centrifuga y se descarta el eluato. Procedemos de la misma manera con el resto de la mezcla.

A dicha columna, a continuación, hay que añadir una solución de lavado de la columna y volver a centrifugar. Se vuelve a repetir este paso (se debe repetir por que es un paso importante para diluir los posibles contaminantes). Tras los dos lavados se descarta la solución de lavado.
Para evitar que quede algún resto de dicha solución se vuelve a centrifugar. Se hace de esta forma porque de lo contrario no se observarían variación de las condiciones cuando se añada la solución de elución.

Pasando la columna a un nuevo tubo colectar le añadimos una solución de elución que se ha debido de calentar con anterioridad a 65 º C, y se centrifuga nuevamente. Como tenemos mucha cantidad en la columna será necesaria hacerlo en dos pasos.

Como tenemos dos muestras de ADN hemos realizado todos estos pasos comentados con brevedad, dos veces.


2) Cuantificación espectrofotométrica de una solución de ADN
Esta determinación espectrofotométrica de la concentración de una solución de ADN está basada, como su propio nombre indica en medidas de absorbancia a 260 nm. Sin embargo, a esa misma longitud de onda absorben otras sustancias con lo que se hace absolutamente necesaria la purificación del ADN. Sería conveniente además asegurarse de que el ADN está puro.

Para llevar a cabo esta comprobación se hace un procedimiento en dos pasos. Por un lado se comprueba el alto peso molecular del ADN. El tamaño se comprueba mediante una electroforesis horizontal en gel de agarosa. Y por otro lado, para comprobar la pureza en sí se realiza un método basado en medidas de absorbancia, a 260 y a 280 nm ya que la relación de ambas absorbancias debe de estar próxima al número 1,8.


3) Visualización de ADN genómico mediante electroforesis en gel de agarosa
Vamos a realizar un desplazamiento de moléculas que van a moverse en función de una diferencia de potencial.

Pero antes de llevar a cabo este procedimiento debemos de preparar el gel de agarosa. Para ello se mezcla en un Erlenmeyer agarosa con tampón de electroforesis (TBE). La agarosa que prepararemos será al 1,7 %. Una vez realizada la mezcla debe ser introducida en un baño de arena hasta que la agarosa esté fundida. Sin embargo hay que tener cuidado para que la agarosa no llegue a la ebullición y para que no queden grumos.


Cuando la mezcla se enfría, llegando a un temperatura aproximada a los
50 º C hay que añadirle bromuro de etidio (este se debe añadir con precaución pues es un agente muy tóxico al intercalarse en los ácidos nucleicos).

A continuación, con toda esta mezcla aún fundida se vierte sobre el portageles (el cual ha debido ser montado adecuadamente), sobre una superficie horizontal. Cuando el gel se solidifique debe ser colocado en una cubeta de electroforesis, la cual se rellena con tampón de electroforesis hasta que cubra al gel.

A la muestra se le debe añadir tampón de carga (este tampón contiene glicerol, tampón tris e indicadores coloreados) para hacerla de mayor densidad y facilitar de estar forma su carga en los pocillos. La mezcla de la muestra con el tampón de carga se hace sobre un papel de parafilm de tal forma que se coloca en primer lugar la gota de tampón en dicho papel y luego, con una pipeta automática tomamos la muestra y vamos absorbiendo el tampón con cuidado y mezclando en varias fases.

Mezclada la muestra se procede a su carga en los pocillos del gel. Se conecta el sistema de electroforesis a la corriente, con un voltaje inicial de 80-100 V. Cuando veamos que las muestras ya han entrado en el gel podemos bajar el voltaje a 50-80 V.

Dejamos correr el gel durante un tiempo. Para poder visualizar los resultados se utiliza un transiluminador, con una lámpara de luz ultravioleta, ya sea de onda corta o larga en función del uso que vaya a hacerse del ADN. Hay que saber que la luz ultravioleta causa daños en el ADN.


4) Reacción de PCR
Como tenemos dos muestras todos los pasos se harán por duplicado.
El primer paso es tener una muestra maestra que contiene un tampón de PCR, dNTPs, cebadores A1 y A9 y Taq polimerasa. A esta muestra maestra además hay que añadir, en cada puesto de trabajo y para cada muestra, el ADN y agua miliQ, hasta conseguir un volumen total de 25 microl.

La PCR consiste en una desnaturalización inicial a 95 º C tras la cual vienen unos 40 ciclos de tres tiempos a distintas temperaturas (95º C, 34 º C y 72 º C). Tras estos ciclos se somete a 72 º C durante un periodo más largo y se mantiene ya a 4º C.

En este punto sería conveniente explicar brevemente lo que es la temperatura de fusión. Se entiende por ésta como la temperatura a la cual el oligo y la cadena molde se separan como consecuencia de una desestabilización. Tras esta separación inicial vuelven a unirse el oligonucleótido y la cadena molde, con lo que vuelven a repetirse los ciclos anteriormente mencionados. También hay que mencionar que mientras más ciclos dejemos la PCR mayor simplificación obtendremos. Pero ahora bien, si son ya excesivos ciclos los que se llevan a cabo pueden comenzar a amplificarse otras cosas que no nos interesan.

Lo que hemos definido anteriormente como extensión final ya no forma parte de una PCR, sino que sirve para acabar de extender aquellos productos que no se hayan extendido durante los ciclos de la PCR.

Otro término que cabe mencionar aquí es el de “Ramping time”, que podría definirse como la velocidad de cambio desde una temperatura a otra distinta, y dependerá de la maquinaria utilizada, aunque también podría controlarse si determinamos nosotros el tiempo: si pasamos de 34 º C a
72 º C inmediatamente el cebador podría separarse. Si hacemos el cambio más lentamente la Taq polimerasa comienza a funcionar y cuando llegue a su temperatura óptima (72 º C) el cebador será de mayor tamaño. Sería por tanto un control de la selectividad.


5) Análisis de los productos de PCR mediante electroforesis en gel de agarosa
Una vez que la PCR ha acabado podemos visualizar los resultados en un gel de agarosa por electroforesis. Se podría utilizar también un gel de acrilamida, pero este es más aconsejable para cuando se quiere llevar a cabo una secuenciación pues su tamaño de poro es menor y permite distinguir fragmentos de ADN que difieren en un solo nucleótido.

En este caso, la cantidad de agarosa usada también es importante, ya que a mayor cantidad de agarosa es entramado será mas fino y permite separar con mas facilidad los fragmentos de ADN de 1 Kb o incluso menores. Usaremos un gel de agarosa al 1,7 % que se realizará siguiendo el mismo procedimiento que ya hemos explicado con anterioridad.

Igualmente, se inicia la electroforesis con el voltaje de 80-100 V hasta que la muestra entre dentro del gel y cuando se visualicen los pocillos transparentes se reduce a 50-80 V. Si dejásemos el voltaje tan alto se podría perder poder de resolución (por ello si sólo quisiésemos comprobar si ha habido amplificación podríamos dejar el alto voltaje).

La imagen obtenida tras correr la muestra y mediante el transiluminador es la siguiente:

6) Análisis de los patrones RAPD
Como se puede comprobar en la imagen, la primera muestra no ha salido y puede deberse a una mala purificación del ADN o a que la PCR no ha ido bien.

En cuanto a la segunda muestra y comparándola con el control podríamos decir que se trata de la muestra 2.2, que sería la especie Manzanilla (coincide con el carril 6 del control).

En cuanto al marcador podemos decir que se ve como un punto seguido porque a la hora de cargarlo en el pocillo se ha roto un poco el gel.