DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA EN PLANTAS: Ensayo de la actividad de la Glutamina Sintetasa (GS) del girasol

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La actividad enzimática es el motor molecular sobre el que se asienta todo el funcionamiento de la planta, luego si queremos realizar un estudio sobre la fisiología vegetal una buena aproximación es llevar a cabo el estudio de la actividad enzimática.


Una de las enzimas más importantes dentro de la planta es la Glutamina Sintetasa, ya que es fundamental en la incorporación del nitrógeno (además de cumplir otras muchas funciones importantes). La reacción que lleva a cabo es:



Nuestra práctica consiste en demostrar si es necesario añadir dos compuestos cuya función ya se mencionará más adelante o si por el contrario con uno sólo basta. Estos compuestos son el beta-mercaptoetanol y la polivinilpolipirrolidona (PVPP).


El primer paso a realizar sería preparar el extracto enzimático a partir del tejido, que en nuestro caso son hojas de girasol. Es necesario conseguir un extracto porque las enzimas se encuentran en los compartimentos celulares y para liberarlos hay que romper las células. Pero cuando los tenemos aislados es necesario estabilizarlos pues de lo contrario perderían su integridad. Con este fin preparamos un tampón de extracción, que entre otras cosas lleva una sustancia:

- Sustancia tamponadora de pH
- Leupeptina: previene la acción de las proteasas liberadas
- beta-mercaptoetanol: inhibe la difenol oxidasa
- Polivinilpolipirrolidona: adsorbe los compuestos fenólicos

Estos dos últimos compuestos son muy importantes, ya que al destruir las células se libera la difenol oxidasa, que convierte los abundantes compuestos fenólicos en o-quinonas, muy oxidantes, responsables de inactivación enzimática.

- Finalmente el compuesto también lleva agua destilada


Como vamos a hacer dos ensayos preparamos dos tampones, uno con todo lo mencionado y otro con todo excepto con beta-mercaptoetanol. A continuación preparamos hojas de girasol, las pesamos, las trituramos usando nitrógeno líquido y añadimos el polvo obtenido a los tubos con el tampón. Se mantiene en hielo. Es necesario además centrifugar para eliminar los restos celulares y exceso de polivinilpolipirrolidona. Del sobrenadante obtenido tomamos 1,5 ml que transferimos a tubos eppendorf. Ya tenemos preparado nuestro extracto enzimático.


Para medir la actividad de dicho extracto nos basamos en la velocidad de reacción del mismo (es decir, medimos la cantidad de sustrato desaparecido o cantidad de producto formado) en unas condiciones tales que:
- Sustratos a condiciones fijas y saturantes
- Temperatura y pH constantes
- Presencia de iones y cofactores


Y además hay que tener muy en cuenta que el ensayo sea lineal con respecto al tiempo de reacción y a la cantidad de extracto ensayado.

Pero ahora nos encontramos un nuevo problema, y es que no podemos detectar fácilmente la actividad de la Glutamina Sintetasa. Por ello, en lugar de medir el amonio o el Glutamato medimos la capacidad que posee la Glutamina Sintetasa de forma gamma-Glutamilhidroxamato:


Esta capacidad de medir el gamma-Glutamilhidroxamato se conoce como ensayo de la actividad transferasa de la Glutamina Sintetasa.


Así pues, preparamos cuatro tubos, dos para cada ensayo. Uno servirá como control (y tendrá más cantidad de agua destilada) y el otro será el ensayo propiamente dicho. Nada más iniciar la reacción en las dos muestras se incuba durante 5 minutos a 35º C. Pasado este tiempo añadimos Mezcla Reveladora y dejamos durante otros 5 minutos, pero ahora a temperatura ambiente. La finalidad de la Mezcla Reveladora es que sus iones Fe3+ reaccionen con el ?-Glutamilhidroxamato en medio ácido formando un complejo coloreado cuya concentración podrá ser cuantificada mediante absorbancia a 500 nm.


Ajustamos en un principio el espectrofotómetro a cero con el tubo control y a continuación mediamos los ensayos. Los valores obtenidos son:

- Tubo con beta-mercaptoetanol: 0,304
- Tubo sin beta-mercaptoetanol: 0,632


Luego mediante estos datos, y observando a simple vista el color de los tubos podemos afirmar que el ensayo sin beta-mercaptoetanol es muy parecido a los controles, en los cuales no hay reacción, luego el beta-mercaptoetanol es necesario para que la enzima funcione. Y por otro lado, la polivinilpolipirrolidona está de más, ya que en el tubo donde no añadimos beta-mercaptoetanol sale lo mismo que en el control y sola no sirve para nada (otra cosa a estudiar sería el efecto conjunto con el beta-mercaptoetanol).


Para finalizar pasemos a calcular la actividad de la enzima en unidades de actividad. La unidad utilizada es el katal (k) que podría definirse como la cantidad enzimática que lleva a cabo la transformación de 1 mol de sustrato en producto en 1 segundo. Luego en realidad sería una medida de la velocidad. Sin embargo, esta medida es muy grande y se suelen usar submúltiplos, como el nkatal, que sería la cantidad enzimática que lleva a cabo la transformación de 1 nmol de sustrato en producto en 1 segundo.


Lo que pretendemos calcular es la actividad por gramo de peso fresco de material extraído, lo que se conoce como actividad específica. El peso se nuestras hojas es de 2,03 g y 1,96 g para el caso de beta-mercaptoetanol y sin beta-mercaptoetanol respectivamente.


Antes de nada hay que decir que es necesario conocer el factor de calibración que relaciona la absorbancia con la concentración. Para ello realizamos una recta de calibrado en las condiciones particulares del ensayo de actividad de la Glutamina Sintetasa. En nuestro caso el valor es F = 2,86


La fórmula a utilizar es la siguiente:


Teniendo en cuenta que el volumen del extracto es de 10 ml y el volumen ensayado es 0,1 ml, sustituyendo obtenemos:

- Ensayo con beta-mercaptoetanol: 1,423 x 10-4 nK/g peso fresco
- Ensayo sin beta-mercaptoetanol: 2,968 x 10-4 nK/g peso fresco