DETECCIÓN DE ACTIVIDAD GUAIACOL PEROXIDASA EN APOPLASTOS DE RAÍZ EN DISTINTAS ESPECIES DE PLANTAS SUPERIORES.

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Las peroxidasas pertenecen a una familia de enzimas que participan en muchas respuestas de las plantas. Podemos diferenciar tres tipos atendiendo al grado de fijación a la pared:

- Unidas covalentemente: unión muy fuerte, con lo cual es muy difícil de separar de las fibras de celulosa. Se usa para ello digestión enzimática.

- Unidas iónicamente: el tratamiento para separarlas no es tan complicado, como puede ser por ejemplo mediante una concentración salina.

- Solubles: también llamadas apoplásticas. Se encuentran de forma libre en el apoplasto. En este caso con una simple centrifugación pueden obtenerse.

Las más importantes son las pertenecientes a este último grupo, participando en la elongación, lignificación, producción de peróxido de hidrógeno...

Todas las peroxidasa pueden funcionar utilizando un donador universal llamado guaiacol, que se trata de un grupo fenólico.


Y esto puede ser utilizado por la planta para muchas reacciones, como puede ser el caso de la síntesis de lignina (lignificación). Cuando entra un patógeno en la planta una de las respuestas es aumentar la cantidad de peroxidasa y por tanto provocar un aumento de lignificación.

En nuestra práctica vamos a utilizar raíces de cebolla (Allium cepa), de maíz (Zea mays), y habichuela (Faceolus vulgaris). Previamente han debido germinar en una batea con abundante humedad. Lavamos con agua destilada. Cortamos las raíces y en una placa de Petri se someten a vacío durante 5 minutos a 50 kPa, ya que entre las paredes celulares hay huecos que se llenan de aire y con el vacío conseguimos eliminarlo. Así de esta manera todos los espacios intercelulares serán inundados por el medio que suministremos (tampón fosfato 10 mM). Mediante centrifugación (unos 150 gramos durante 5 minutos, con lo cual vamos a obtener un volumen de entre 200 y 300 microlitros por gramos de peso fresco), asegurándonos de que no sea demasiado fuerte y obtener así sólo en contenido de la pared celular. El tampón fosfato además ayuda a arrancar mejor el apoplasto.

Evidentemente cada planta tendrá una cantidad de proteína diferente. Para calcular dicha cantidad se utiliza la técnica de Bradford. Para la actividad se utiliza un espectrofotómetro, basándonos en que los fenoles, conforme van dimerizando tomar color rojo y hay un aumento de la absorbancia. En el espectrofotómetro se usa una mezcla de reacción compuesta por 100 microlitros de agua oxigenada (0,3 %), 100 micro litros de guaiacol al 1%, 5 microlitros de apoplasto y 1 ml buffer fosfato sódica 10 mM a pH 6. Se mide a 470 nm durante 2 o 3 minutos. Al final hemos obtenido un volumen de 1 ml.

Para medir la absorbancia primero se toma la medida de un blanco de referencia que tiene lo mismo que nuestra muestra excepto el agua oxigenada.

Veamos lo que ocurre con la habichuela. Observamos una tendencia a una cinética de saturación. Habría que medir la velocidad desde cero hasta donde parece ser que empieza a saturarse:

* t = 0 y t = 1,95 ------> Vm = 59,81 nmoles guaiacol oxidado/minuto
* t = 0 y t = 0,34 ------> V = 93,42 nmoles guaiacol oxidado/minuto
* t = 2,64 y t = 3,89 ----> V = 75 nmoles guaiacol oxidado /minuto


Se observa por tanto que la velocidad no es constante, habiendo mucha rapidez al principio y un posterior enlentecimiento.

Vamos a ver que ocurre con la mitad de muestra (5 microlitros) y más tampón (795 microlitros). Comprobamos que la reacción avanza más tranquilamente, y como hemos puesto la mitad de proteína teóricamente debería haber la mitad de la velocidad.

* Vm = 38,02 nmoles guaiacol oxidado/minuto.
* t = 0 y t = 0,34 ------> V = 71,02 nmoles guaiacol oxidado/minuto.
* t = 2 y t = 2,5 --------> V = 25,04 nmoles guaiacol oxidado/minuto.

Y comprobamos, por tanto, que con menos cantidad de proteína baja mucho la velocidad de la cinética de Michaelis-Menten.


Pasemos a ver que ocurre con la raíz de la cebolla. Cogemos 5 microlitros de apoplasto. En esta ocasión hay mucha menos saturación.


* Vm = 0,25 nmoles guaiacol oxidado/minuto.
* t = 0 y t = 0,6 -------> V = 0,02 nmoles guaiacol oxidado/minuto.
* t = 2,1 y t = 2,5 -----> V = 0,5 nmoles guaiacol oxidado/minuto.


Y para el maíz, también con 5 microlitros de apoplasto:


Como vamos a considerarla como lineal haría falta únicamente el valor medio, aunque como dato daremos también los demás:

* Vm = 13,90 nmoles guaiacol oxidado/minuto.
* t = 0 y t =0,3 ------> V = 8,56 nmoles guaiacol oxidado/minuto.
* t = 2 y t = 2,5 -----> V = 13,08 nmoles guaiacol oxidado/minuto.


A continuación mediante el Bradford vamos a obtener la cantidad de proteínas. Para ello se han preparado 7 cubetas y en cada una de ellas se le añaden 50 ----micro litros de NaOH, 10 microlitros de apoplasto y 1 ml de reactivo de Bradford. se agita con papel de parafilm y se incuba durante 10-30 minutos. A continuación se determina la absorbancia a 590 nm. Se utilizan dos valores por muestra y calculamos la media. Obtenemos:

- Cebolla:
* 1,54 microgramos/5 microl
* 2,62

* media = 2,08 microgramos de proteína en 5microlitros.


- maíz:
* 3,57
* 3,63

* Media = 3,60


- Habichuela:
* 30,67
* 31,50

* Media = 31,085


Y a continuación, con la velocidad media y la cantidad de proteína podemos calcular la actividad específica:

- Cebolla: Si 2,08 microg --------------> 0,25 nmoles

1000 ----------------------------> x

x = 120,192(nmoles/ min mg proteína)


- Maíz: 3861,11

- Habichuela: 1223,09


Con este método comprobamos que la habichuela tiene una gran cantidad de proteína, con lo cual la saturación ocurre muy pronto, tal como se comprobó en la gráfica, pero no por ello quiere decir que tenga gran actividad específica, pues el maíz, con 10 veces menos proteína consigue mayor actividad específica. Ambos se encontraban en igualdad de condiciones y en idéntico cultivo, con papel de filtro. Puede deberse a que como el maíz es una planta monocotiledónea necesita mayor defensa frente a patógenos y lo consigue mediante un aumento en la actividad específica peroxidasa.

En cuanto a la cebolla, su bajo valor puede deberse a que como su cultivo era hidropónico las necesidades de nutrientes están todas cubiertas y no hay ningún tipo de estrés que potencia la actividad peroxidasa.