APLICACIÓN DE LA PCR EN LA IDENTIFICACIÓN DE MUTANTES KNOCKOUT EN UN GEN XILANASA DEL HONGO FUSARIUM OXYSPORUM

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La PCR fue descubierta por Kary B. Mullis en 1990 y mediante esta técnica se pueden fabricar copias de fragmentos de ADN sin límite. Las condiciones que hay que tener es una cadena molde de ADN monocatenario (desnaturalizando una de ADN doble), dos cebadores en cadena opuesta y enfrentados, una polimerasa y los cuatro desoxinucleótidos.

Como aplicación de la PCR hemos visto la identificación de diferencias en la secuencia de mutantes. Para ello se ha inactivado el gen que codifica una xylanasa extracelular. Por transformación genética se introduce una copia del gen sustituyendo la región codificante por un gen marcado que en este caso es de resistencia a un antibiótico.

Ya en los transformantes se buscan en los dobles recombinantes aquellos que hayan integrado la construcción en sitio homólogo. Pero puede ser que el gen se haya integrado en cualquier otro sitio del genomio, siendo un transformante ectópico.

Los mutantes se pueden seleccionar mediante detección bioquímica (actividad xylanasa o no). También mediante análisis Southern.

Mediante la PCR vamos a tener que en el sitio homólogo obtenemos una banda de amplificación mientras que en el recombinante ectópico no obtenemos dicha banda. Esto sería para el gen del fármaco. Si usamos un cebador que se encuentre en la región de gen xylanasa siempre obtenemos amplificación, tanto en el homólogo como en el ectópico.

Las combinaciones de cebadores van a ser:
1) Eg 5 (Tm 60º C) + Hph 1 (Tm 60º C).
2) Eg 20 (Tm 60 º C) + Hph 1 (Tm 60º C) (más grande).

Tm = temperatura a la cual la mitad de los cebadores está asociada a la secuencia
diana.

Ya en nuestra práctica hemos añadido 5 microlitros de mezcla de la reacción de PCR:
- Tampón 10x de PCR.
- dNTPs.
- oligo A
- oligo B
- Taq. polimerasa.
- agua mQ.

Además se añaden 5 microlitros ADN del hongo.

El aparato para la PCR va a seguir los siguientes pasos:
1) Despolimerización a 90 ºC 2 minutos.
2) Apareamiento con cebadores a una temperatura que dependerá:
- Secuencia nucleotídica.
- Cebador:
* porcentaje de C-G.
* Tamaño cebador.

3) Polimerización.

Se añade fuente de electroforesis y se carga en un gel al 1 % de agarosa. Obtenemos:

9a Mezcla 1 ---> amplifica
9a Mezcla 2 ---> amplifica
80a Mezcla 1 ---> no amplifica
80a Mezcla 2 ---> amplifica
9a Mezcla 1 ---> amplifica
80a Mezcla 1 ---> no amplifica

Y de estos valores podemos deducir que el 9a es el homólogo puesto que siempre encontramos la banda de amplificación.